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Diagnosi Preimpianto + Tipizzazione
HLA: il caso del piccolo Luca
Francesco Fiorentino e Anver Kuliev
(tratto da Darwin anno 2005 nr. 4 pag. 84-88)
Lo scorso settembre in Italia ha fatto clamore il caso di
Luca, il bambino di origine turca affetto da talassemia che
è stato curato con trapianto di cellule staminali prelevate
dal cordone ombelicale delle sue sorelle gemelle. La nascita
delle due bambine, non affette da talassemia e
istocompatibili con il fratello maggiore, è stata resa
possibile dal ricorso alle tecniche di fecondazione
assistita e alla diagnosi genetica preimpianto. Da 12
embrioni allo stadio di 8 cellule è stata prelevata una
cellula (o blastomero). Il DNA di queste cellule è stato
sottoposto contemporaneamente ad analisi del DNA per la
ricerca di mutazioni associate alla beta talassemia e
tipizzazione del complesso maggiore di istocompatibilità (Human
leukocyte antigen o HLA) mediante reazione di
microsequenziamento (minisequencing); tre embrioni sono
risultati privi della malattia e al tempo stesso dotati di
geni dell’HLA identici a quelli di Luca, e quindi adatti a
evitare reazioni di rigetto dopo trapianto. La metodica
impiegata, unica nel suo genere, è stata recentemente
pubblicata da un gruppo di ricercatori italiani sul volume
di giugno della rivista Molecular Human Reproduction (Development
and clinical application of a strategy for preimpiantation
genetic diagnosis of single gene disorders combined with HLA
matching, Fiorentino F. et al., Molecular Human Reproduction
Vol 10, N. 6, pp. 445-460). Da questi embrioni sono nati due
gemelle, il cui cordone ombelicale è servito per estrarre le
cellule staminali che sono state trapiantate al piccolo Luca
al Policlinico San Matteo di Pavia.
Nonostante lo scalpore suscitato da questa
notizia, la diagnosi genetica preimpianto (PGD) – che viene
eseguita sugli embrioni generati in vitro prima del
trasferimento in utero - è una tecnica che ha quasi 15 anni
e si è ormai affermata come opzione clinica nella medicina
riproduttiva. Pur essendo stata introdotta nel 1990 per
diagnosticare solo malattie genetiche caratterizzate da
ereditarietà di tipo mendeliano – il primo gene testato è
stato quello per la fibrosi cistica - il campo di
applicazione è andato via via allargandosi. Attualmente
esistono protocolli diagnostici per oltre 50 malattie
monogeniche, autosomiche dominanti, recessive o legate al
cromosoma X. Patologie genetiche molto diffuse in cui la PGD
oggi trova applicazione comprendono beta-talassemia, anemia
falciforme, emofilia A e B, distrofia muscolare di
Duchenne-Becker, distrofia miotonica, fibrosi cistica,
atrofia muscolare spinale, sindrome di Lesch-Nyhan, malattia
di Charcot-Marie-Tooth, alfa-1-antitripsina e X-fragile. Nel
1993-1994 l’introduzione dell’analisi con ibridizzazione in
situ con sonde fluorescenti (FISH) per i disordini
cromosomici ha fatto sì che il numero di cicli di PGD
raddoppiasse annualmente.
Un altro passo in avanti è stato fatto a
partire dal 1996, quando è diventato possibile identificare
le traslocazioni cromosomiche– alterazioni in cui un
segmento cromosomico cambia posizione – grazie allo sviluppo
di diversi tipi di sonde (dapprima quelle FISH
locus-specifiche poi quelle subtelomeriche). Chi è portatore
di traslocazioni bilanciate – ovvero anomalie di struttura
dei cromosomi che non comportano perdita né guadagno di
materiale genetico – è perfettamente sano ma un’alta
percentuale dei suoi gameti può presentare gravi anomalie
cromosomiche. Queste persone hanno una probabilità inferiore
alla media di mettere al mondo figli sani, ma la PGD
consente loro di selezionare gli embrioni privi di
traslocazioni sbilanciate. Un’ulteriore espansione si è
verificata nel 1999, quando la tecnica è stata applicata per
la prima volta a malattie a insorgenza tardiva, come
Alzheimer e tumori a base genetica. Si può stimare che nel
mondo siano stati eseguiti in tutto oltre 6000 cicli e che i
bambini nati siano almeno un migliaio. Grazie
all’accresciuta accuratezza dell’analisi genetica e
all’allargarsi delle indicazioni oltre quelle previste per
la diagnosi prenatale, il ricorso alla PGD è in costante
crescita. Ogni anno vengono effettuati circa 1000 cicli in
tutto il mondo e negli ultimi due anni le nascite avvenute
dopo PGD hanno quasi eguagliato il numero dei bambini venuti
al mondo allo stesso modo nei primi dieci anni di vita della
tecnica.
La PGD ha consentito a centinaia di coppie ad
alto rischio di malattie genetiche non solo di avere figli
sani, ma soprattutto di raggiungere questo risultato senza
correre il rischio di un’interruzione di gravidanza dopo una
diagnosi prenatale tradizionale effettuata entro le prime
10-16 settimane di gestazione (amniocentesi e villocentesi).
Senza PGD probabilmente sarebbero nati ben pochi di questi
bambini.
L’impatto numerico maggiore della PGD
comunque riguarda le pratiche standard di riproduzione
assistita, dove questa tecnica che serve per aumentare
l’efficienza della fecondazione in vitro si appresta a
diventare di routine per le coppie in cui la donna ha un’età
superiore ai 37 anni e quindi la qualità degli ovociti è in
fase di declino fisiologico oppure per le coppie in cui le
tecnologie convenzionali di riproduzione assistita non hanno
avuto successo. Identificando con l’aiuto di opportune sonde
gli embrioni euploidi, cioè quelli che non presentano
anomalie nel numero dei cromosomi, sembra possibile superare
le limitazioni delle pratiche classiche, che prevedono una
selezione degli embrioni da trasferire in utero soltanto su
base morfologica. Il trasferimento degli embrioni euploidi,
che sono anche i più vitali, consente di aumentare il tasso
di successo in pazienti che avrebbero ben poche chance di
portare a termine una gravidanza con le tecniche classiche.
In aumento è anche il numero di interventi
per creare donatori di cellule staminali HLA compatibili,
come quello che ha portato alla nascita dei fratellini di
Luca. La presenza di geni HLA identici tra donatore e
ricevente infatti è un requisito indispensabile per far sì
che le cellule staminali si insedino e sopravvivano.
Il più grande studio sul trapianto di midollo
per le emoglobinopatie (malattie ereditarie dovute a errori
nella sintesi dell’emoglobina come talassemia e anemia
falciforme) comprende oltre 1000 pazienti e presenta una
percentuale di successi superiore all’80% per pazienti con
età inferiore a 17 anni. Tuttavia a causa della dimensione
ridotta dei nuclei familiari solo un terzo dei pazienti
dispone di una sorella o di un fratello HLA -identico. Il 3%
degli esclusi può trovare un donatore con uno o due aplotipi
ancestrali identici utilizzando una ricerca familiare
estesa. Per gli altri l’unica possibilità è
l’identificazione di un donatore non imparentato attraverso
l’utilizzo di appositi registri nazionali. Il trapianto di
cellule staminali del cordone ombelicale ha il potenziale di
espandere ulteriormente il pool dei donatori per i pazienti
che non trovano la combinazione genetica giusta in famiglia.
Questo approccio è stato già utilizzato per 2500 bambini e
oltre 1000 adulti. Il trapianto di cellule staminali del
cordone ombelicale consente un grado di diversità maggiore
dei geni HLA tra donatore e ricevente, ma la disponibilità
di unità che derivano da un fratello HLA identico offre
maggiori garanzie, consentendo trapianti più precoci e un
minor rischio di complicazioni e mortalità legata al
trattamento.
Disporre di un fratello donatore HLA identico
è di particolare utilità per i pazienti affetti da anemia di
Fanconi - una malattia spesso fatale di cui esiste un
cluster in provincia di Benevento - che le cellule del
cordone ombelicale consentono di trattare con successo in
oltre l’85% dei casi. La nascita del primo bambino-donatore,
che è avvenuta nel 2000 nel centro di Chicago ad opera di
uno dei due autori di questo articolo, è servita proprio a
trattare una bambina affetta da anemia di Fanconi (Preimplantation
diagnosis for Fanconi anemia combined with Hla matching,
Verlinsky et al., Jama, vol. 285, pp. 3130-3133, 2001).
Prima le coppie con un figlio affetto da
questa malattia erano costrette ad affidarsi alla lotteria
genetica della riproduzione naturale, tentando il
concepimento di un altro figlio che fungesse da donatore e
valutando la compatibilità HLA solo a gravidanza avanzata
grazie a villocentesi e amniocentesi. In questo modo sono
state avviate più di 80 gravidanze, di cui una nel 1988 ha
portato al primo trapianto di cellule del cordone ombelicale
coronato da successo (Hematopoietic reconstitution in a
patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord
blood from Hla-identical sibling, Gluckman E. et al., New
England Journal of Medicine, Vol. 321, pp. 1174-1178, 1989).
La probabilità teorica di avere un bambino sano e allo
stesso tempo dotato dei geni HLA compatibili però è soltanto
di uno su cinque.
Addirittura studi condotti sugli embrioni
hanno evidenziato che la probabilità reale diventa di circa
uno su otto. Molte di queste famiglie perciò hanno dovuto
affrontare gravidanze ripetute, ritardando il trapianto e
rischiando di dover scegliere la dolorosa strada dell’aborto
nel caso i feti fossero risultati malati. In confronto la
diagnosi genetica preimpianto offre vantaggi più che
evidenti, perché consente di testare un numero sufficiente
di embrioni per volta, aumentando le possibilità di trovare
quello con le caratteristiche adatte per la donazione. Ma
soprattutto la PGD permette di identificare questo embrione
prima che venga avviata una gravidanza, eliminando il
rischio che vengano abortiti i feti che non risultano HLA
compatibili.
Un convegno che si è svolto a Cipro di
recente ha consentito di fare il punto sulla diffusione di
questo approccio, che tecnicamente viene definito “PGD for
HLA matching o Preimplantation HLA matching” ed è già stato
applicato in 4 paesi - Stati Uniti, Australia, Belgio e
Turchia (analisi condotta da un gruppo di ricercatori
italiani, “ospitati” in un centro di Istanbul in quanto la
legge 40 non lo consente) La maggioranza dei 147 cicli
effettuati ha riguardato casi di talassemia e anemia di
Fanconi ma la lista di malattie interessate è lunga ed è
destinata a crescere. Circa l’80% delle coppie si è rivolta
ai centri di Chicago e Istanbul, che hanno già visto nascere
15 bambini potenziali donatori per i fratelli bisognosi di
un trapianto di midollo osseo (Preimplantation Hla typing
and stem cell transplantation; report of international
meeting, Cyprus, 27-28 March, 2004, Kuliev A. e Verlinsky
Y., RBM Online, Vol. 9, N. 2, pp. 205-209, 14 giungo 2004).
Tra questi casi ce ne sono anche alcuni per i quali è stato
eseguito soltanto il test di compatibilità HLA, perché
l’embrione non era a rischio di malattie genetiche. I
fratelli in attesa di trapianto, infatti, erano affetti da
malattie non ereditarie come leucemia e anemia sporadica di
Diamond-Blackfan.
Considerazioni di tipo etico hanno reso più
difficile l’accesso di questi piccoli pazienti ai trapianti
salva-vita: nel caso delle malattie ereditarie infatti la
diagnosi genetica preimpianto serviva anche per assicurare
la salute del concepito oltre che a garantire l’istocompatibilità
per la donazione, mentre per malattie non ereditarie il
nuovo nato non trarrebbe alcun vantaggio dalla tecnica
utilizzata per concepirlo. E’ così che nell’aprile del 2003
l’authority britannica - Human Fertilisation & Embryology
Authority - ha dato il via libera per eseguire la
Preimplantation HLA matching per curare un bambino
talassemico mentre l’anno prima aveva respinto un’analoga
richiesta presentata dai genitori di un piccolo malato di
anemia di Diamond-Blackfan. La coppia inglese perciò ha
dovuto recarsi negli Stati Uniti e il bambino è in corso di
guarigione grazie al trapianto di midollo osseo donato dal
fratellino di un anno (Preimplantation Hla testing,
Verlinsky et al., Jama, Vol. 291, N. 17, pp. 2079-2085, 5
maggio 2004).
Da allora però si sono accumulati dati
secondo cui i rischi corsi dagli embrioni durante la biopsia
effettuata per eseguire la diagnosi genetica preimpianto
sono minimi e nel luglio di quest’anno l’authority
britannica ha annunciato la caduta del divieto. In Italia
invece la legge 40 sulla fecondazione assistita non solo ha
messo fuori legge la Preimplantation HLA matching, spingendo
10 coppie a rivolgersi all’estero. Ma ha vietato tutti i
tipi di diagnosi genetica preimpianto, per le coppie a
rischio di malattie genetiche, traslocazioni, malattie a
insorgenza tardiva e aneuploidie, frustrando il desiderio di
genitorialità di migliaia di coppie e ponendo inutili
ostacoli per la salute di migliaia di bambini.
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