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PGD per tipizzazione HLA: Analisi genetica del blastomero
 L’analisi
genetica da singola cellula è una tecnica molto complessa,
che richiede una notevole esperienza professionale e
l’impiego di tecnologie strumentale avanzate. Dal punto di
vista procedurale, la PGD è totalmente differente dalla
diagnosi genetica prenatale. Infatti, dai prelievi dei
tessuti fetali si estrae una notevole quantità di DNA,
derivante da centinaia di migliaia di cellule.
Inoltre, in caso vi sia un dubbio interpretativo e’
possibile di ripetere il test, poiché non vi sono
restrizioni temporali ed e’ disponibile una cospicua
quantità di cellule fetali. Nella diagnosi preimpianto,
invece, il materiale su cui viene eseguito l’esame genetico
è rappresentato da una singola cellula (e quindi una sola
copia di DNA); inoltre i tempi sono molto ristretti, in
quanto l’esame deve essere completato in tempo utile per il
transfer, entro il day 5. Com’è facilmente comprensibile,
ciò incide notevolmente sulla scelta della strategia
operativa da seguire, che deve essere rapida, precisa e deve
fornire risultati univoci, in tempi estremamente rapidi.
Una volta introdotti i singoli blastomeri all’interno di
differenti provette analitiche, si aggiunge una soluzione
che consente la lisi delle cellule, e quindi la liberazione
del DNA dal nucleo cellulare. Successivamente, mediante una
reazione di amplificazione enzimatica in vitro, conosciuta
come Polymerase Chain reaction (PCR), si amplifica milioni
di volte la regione genica d’interesse (dove, cioè, sono
localizzate le mutazioni che causano la specifica malattia
e/o la regione HLA).
 In
pratica, considerando la molecola del DNA come un “grosso
libro” e la regione genica d’interesse come una “pagina” di
questo libro, con la metodica PCR si "fotocopia" milioni di
volte questa “pagina”, fino ad ottenerne una quantità
sufficiente per essere rilevata dalla strumentazione
analitica. Dopo la reazione di amplificazione enzimatica, il
prodotto di amplificazione viene quindi sottoposto ad
analisi di mutazione per la ricerca delle mutazioni geniche
presenti nella coppia. L’intera procedura viene solitamente
completata entro 24 ore dalla fertilizzazione, in tempo per
effettuare il transfer degli embrioni in day 4 o day 5.
L’analisi di mutazione rappresenta la fase più importante e
delicata della PGD. Per garantire la massima affidabilità
interpretativa è indispensabile che sia effettuata da
personale qualificato, con notevole esperienza nel settore,
e con l’impiego di metodiche e strumentazioni analitiche che
permettono di ottenere una diagnosi univoca, che non lasci
dubbi interpretativi. L'analisi di sequenza automatizzata,
attualmente, rappresenta il miglior metodo di analisi
genetica, in quanto consente l'esatta determinazione e
visualizzazione diretta di una specifica mutazione
(Fiorentino et al., 2003). L'applicazione di tale tecnica
alla PGD, viene eseguita impiegando sofisticate
strumentazioni di ultima generazione, completamente
automatizzate.
Nell’immagine di cui sopra vengono mostrati i risultati
dell'analisi genetica di un caso di PGD di Beta Talassemia
eseguito mediante la nuova metodica del Minisequencing,
ottimizzata dal Ns. Laboratorio e pubblicata nella rivista
scientifica internazionale Molecular Human Reproduction.(Fiorentino
et al., Molecular Human Reproduction Vol.9 No.7 pp. 399-410,
2003)
Per quanto riguarda la tipizzazione dell’HLA, la strategia
diagnostica che si impiega su singola cellula è diversa da
quella utilizzata su sangue periferico. L’approccio
analitico per PGD, infatti, prevede una tipizzazione
indiretta (analisi di linkage) mediante l’impiego di diversi
marcatori genetici polimorfici Short Tandem Repeats (STR),
localizzati lungo la regione HLA (fig. 1 e 2). La
genotipizzazione di questi markers permette di ottenere il
profilo genetico specifico, per la regione HLA, del bambino
affetto della coppia. Tale profilo verrà quindi ricercato
anche nelle cellule embrionali; gli embrioni a cui verrà
riscontrato il medesimo profilo genetico per la regione HLA
del bambino della coppia, saranno diagnosticati come
HLA-identici o HLA-compatibili e quindi considerati idonei
per il transfer.
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